在科研領(lǐng)域，準(zhǔn)確測(cè)定小鼠體內(nèi)雌三醇（E3）含量對(duì)于深入了解生理和病理機(jī)制至關(guān)重要。小鼠雌三醇（E3）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）專(zhuān)為科研人員提供了一種可靠的檢測(cè)手段，可用于定量檢測(cè)血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液及組織中的小鼠雌三醇（E3）含量。
實(shí)驗(yàn)原理與特點(diǎn)
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法。預(yù)先包被雌三醇（E3）抗體的微孔板，依次加入樣本 / 校準(zhǔn)品和 Asaay Diluent，溫育洗滌后，加入 SA - HRP 再次溫育。經(jīng)洗滌后加入底物 TMB 顯色，室溫顯色后用終止液終止反應(yīng)，讀取 OD 值。值得注意的是，OD 值高低與樣品中的雌三醇（E3）呈負(fù)相關(guān)。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，能可靠地檢測(cè)出血清中雌三醇（E3）的變化。
試劑盒使用限制
使用本試劑盒時(shí)，需嚴(yán)格遵循以下限制：僅用于科研，嚴(yán)禁臨床診斷；在有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品切勿使用；不能與其他廠家的試劑盒或組分混用；若樣品需稀釋?zhuān)捎?PBS（PH7.4）；樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，需適當(dāng)稀釋后重新測(cè)定；檢測(cè)前需排除待測(cè)樣本中可能干擾結(jié)果的異嗜抗體；通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具直接可比性。
技術(shù)操作要點(diǎn)
為確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，需留意諸多技術(shù)要點(diǎn)。混合蛋白溶液時(shí)避免起泡；加校準(zhǔn)品與樣本要更換移液槍頭，公共組分懸臂加樣防交叉污染；保證合適的溫育時(shí)間和充分的洗滌步驟；使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)增加 30 秒浸泡步驟可提高精度；底物溶液變藍(lán)則失效；終止液加樣順序與底物一致，加入后藍(lán)色底物產(chǎn)物變黃；用剩板條立即放回自封袋密封低溫干燥保存；所有液體組分使用前充分搖勻，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。
試劑盒組分與保存
試劑盒包含多種組分，校準(zhǔn)品為抗原配制的 6 個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品（0.5ml / 管 * 6 管，濃度依次為 1400、700、350、175、87.5、0pg/mL），還有預(yù)包被固相抗體的包被微孔板（96T/48T）、HRP 標(biāo)記的 SA - HRP（12mL）、用于分離 E3 與結(jié)合蛋白的 Asaay Diluent（12mL）、TMB 工作液（12mL）、2mol/L 稀釋液的終止液（12mL）、含 0.15% Tween20 的 20× 濃縮洗滌液（30mL），以及說(shuō)明書(shū)、自封袋、不干膠等。未開(kāi)封的試劑盒需保存在 2 - 8℃，過(guò)期禁用。
生物安全注意事項(xiàng)
生物安全至關(guān)重要。檢測(cè)需符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范，防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和廢棄物按傳染物處置。試劑盒液體組分含 proclin - 300 防腐劑，可能致皮膚過(guò)敏，避免吸入煙霧與皮膚接觸；底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激，同樣要避免吸入煙霧；實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)戴防護(hù)手套，完成后徹底洗手。
樣品采集與儲(chǔ)存
不同樣本采集方法各異。細(xì)胞培養(yǎng)上清需在 4000rpm 離心 20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在 20℃以下，避免反復(fù)凍融；血清采集要用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，避免細(xì)胞刺激，4000rpm 離心 20min 后分離血清，保存在 - 20℃以下，避免反復(fù)凍融；血漿采集用肝素、EDTA 或檸檬酸鈉抗凝，4000rpm 離心 20min 取上清，保存在 - 20℃以下，避免反復(fù)凍融；組織需用預(yù)冷 PBS 沖洗、剪碎，與對(duì)應(yīng)體積 PBS 混合研磨，可超聲破碎或反復(fù)凍融，5000×g 離心 5 - 10 分鐘取上清檢測(cè)。樣本在 2 - 8℃可儲(chǔ)存 72h，或在 - 20℃儲(chǔ)存 6 個(gè)月，收集后若未一次檢測(cè)完，需按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)室溫解凍并確保均勻充分。
檢驗(yàn)方法與操作程序
檢驗(yàn)操作需嚴(yán)格按步驟進(jìn)行。先將試劑移至室溫平衡兩小時(shí)，按 1：20 用蒸餾水稀釋濃縮洗滌液備用。取出預(yù)包被板，設(shè)空白對(duì)照孔，校準(zhǔn)品每濃度設(shè) 2 孔，每孔加 15μl，檢測(cè)孔加 15μl 待測(cè)血清或質(zhì)控品。除空白孔外，各孔加 100μl Asaay Diluent，混勻后 37℃溫育 60 分鐘。洗板可選擇手工（棄液、注滿(mǎn)洗滌液靜置 10 秒甩干，重復(fù) 3 次后拍干）或洗板機(jī)（選擇洗滌 3 次程序洗板后拍干）。之后每孔加 100μl SA - HRP（空白對(duì)照孔除外），混勻后 37℃溫育 30 分鐘，再次洗板。每孔加 100μl TMB，37℃避光顯色 15 分鐘后加 100μl 終止液，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下，以空白對(duì)照孔調(diào)零，測(cè)定各孔 OD 值。
結(jié)果計(jì)算與性能指標(biāo)
檢測(cè)完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，吸光度（OD 值）為橫坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件采用四參數(shù) Logistic 曲線擬合（4 - pl）創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過(guò)樣本吸光度計(jì)算濃度值。若樣品被稀釋?zhuān)脻舛戎敌璩艘韵♂尡稊?shù)得到最終濃度。
試劑盒性能指標(biāo)良好。物理性能上，液體組分應(yīng)澄清無(wú)沉淀，各組分無(wú)包裝破損且裝量達(dá)標(biāo)；劑量反應(yīng)曲線線性方面，四參數(shù) Logistic 曲線擬合相關(guān)系數(shù)（r）絕對(duì)值不低于 0.9900；精密度上，批內(nèi)、批間變異系數(shù) CV% 均小于 15%；靈敏度高，最低檢出限不高于 1.0pg/mL；回收率在 85% - 115% 之間；穩(wěn)定性好，2℃ - 8℃保存有效期 6 個(gè)月；檢測(cè)范圍為 87.5 pg/mL – 1400 pg/mL。
小鼠雌三醇（E3）ELISA 試劑盒憑借其科學(xué)的原理、嚴(yán)格的操作規(guī)范和可靠的性能，為科研工作者在小鼠雌三醇研究中提供了有力支持。